结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册技术审查指导原则\t（二）
2015/9/27 弗锐达医疗器械资讯
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(七)临床试验
1.临床试验机构的选择
申请人应当选定不少于3家(含3家)临床试验机构，按照有关规定开展临床试验。临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。申请人应根据产品特点及其预期用途，综合不同地区人种、流行病学背景、病原微生物的特性等因素选择临床试验机构。临床试验机构必须具有与申报试剂相适应的专业技术人员及仪器设备，并能够确保该项试验的实施。
2.临床试验样本的选择和样本量
临床试验对象的选择应满足如下条件：
(1)具有肺结核症状/体征的疑似肺结核患者病例，不建议选择正常健康人群；
(2)最终临床诊断为肺结核患者的病例不少于350例，并且涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例应不小于50%；
(3)应包括其他易混淆疾病的病例(最终临床诊断确定不是肺结核)，以对申报试剂的特异性进行评价，此部分病例不少于150例；
(4)每个临床试验对象的临床样本应足量，以便同时进行申报试剂、对比试剂和其他合理方法的检测。
鉴于痰和支气管肺泡灌洗液样本之间的差异较大，如果申报试剂同时适用于两种样本类型，每种样本类型的例数不少于500例。
临床试验应以新鲜样本为主，如采用冻存样本应另行说明。
如果某种样本类型适用于多种样本前处理方法，应进行不少于150例同源样本的对比试验，证明不同的样本前处理方法不会影响检测结果。其中，最终临床诊断为肺结核患者的病例不少于100例，涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例(最终临床诊断确定不是肺结核)不少于50例。
如果某种样本类型适用于多种核酸提取/纯化方法，应进行不少于150例同源样本的对比试验，证明不同的核酸提取/纯化方法不会影响检测结果。其中，最终临床诊断为肺结核患者的病例不少于100例，涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例(最终临床诊断确定不是肺结核)不少于50例。
3.对比试剂的选择
3.1对于“已有同品种批准上市”试剂的临床试验，申请人可按照法规要求选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用申报试剂与对比试剂进行比较研究试验，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。同时，申请人还应选择一定数量的临床样本进行申报试剂与培养鉴定方法的对比研究，每种样本类型不少于100例，其中涂片阴性和阳性各至少50例。培养方法可采用传统的固体培养方法或临床普遍认可的液体培养方法，菌种鉴定方法可采用对硝基苯甲酸(p-methylbenzylsulfonyl，PNB)、测序、高性能的液相层析、质谱、或其他已上市的核酸检测试剂盒方法。临床研究报告应对采用的培养鉴定方法做详细介绍。
3.2对于无法选择对比试剂的新结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂，其临床试验应选择培养鉴定和/或核酸序列测定(测序)方法作为对比方法，总例数不少于500例。
3.2.1 有关培养鉴定方法的要求同3.1。
3.2.2 临床研究报告应对选用的测序方法做详细介绍。申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需由临床试验机构签章确认。
3.2.2.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
3.2.2.2测序方法所用引物相关信息，如核酸序列选择、分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应合理涵盖申报试剂扩增的靶核酸区段。
3.2.2.3 对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报试剂的相关性能进行适当比对分析。
3.2.2.4 测序方法应建立合理的阳性和阴性质控品，以对临床样本的检测结果进行质量控制。
3.2.2.5 提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
如果申报试剂同时适用于几种不同的临床样本类型、样本前处理方法和核酸提取/纯化方法，每种样本类型应明确规定其适用的样本前处理方法(一种或几种)和核酸提取/纯化方法(一种或几种)。如果申报试剂最终仅保留某种样本类型、某种样本前处理方法和某种核酸提取/纯化方法，临床试验应采用该组合进行。
4.临床试验方法、临床数据及统计分析
4.1应在临床试验方案或者临床试验报告中详细描述申报试剂和对比试剂的具体操作步骤。应明确每个试验阴阳性的判定标准，特别应明确何为培养鉴定的阴阳性。
4.2在临床报告中，以列表的方式，明确：总样本例数、临床诊断为肺结核的患者总例数、涂片阴性的肺结核患者例数、涂片阳性的肺结核患者例数、非结核的其他呼吸道疾病患者与易混淆疾病样本例数，以判断病例选择的科学合理性。
4.3临床试验数据应以列表的方式表示，包括每个样本的涂片结果、临床诊断结果、申报试剂的结果、对比试剂的结果。
4.4对临床试验数据的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、受试者工作特征(ROC)曲线分析、阴性/阳性符合率等。
4.5申报试剂对涂片阴性的肺结核患者应有一定的检出率；申报试剂对涂片阳性肺结核患者的检出率至少为90%；申报试剂的临床特异性至少为90%。
4.6临床试验中的某些样本，采用申报试剂检测时为阳性，采用培养鉴定方法检测时为阴性，出现这种情况的原因有：样本前处理导致结核菌的培养受抑制；样本中结核菌的浓度过低。这可能导致申报试剂的特异性低。因此，在进行4.4统计分析的同时，建议进行申报试剂与最终临床诊断的对比统计分析，以客观地反应申报试剂的临床特异性。
对于申报试剂与对比试剂(或对比方法)的等效性评价，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床试验方案中应明确统计检验假设，即评价申报试剂与对比试剂(或对比方法)是否等效的标准。
5.结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用金标准或其他合理方法进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。如无需复核，应详细说明理由。
6.临床试验方案
临床试验实施前，研究者应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床试验方案。各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的样本入选/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。另外，申报试剂的样本类型不应超越对比试剂对样本类型的检测要求。
7.临床试验报告的撰写
根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床试验报告中对以下内容进行详述。
7.1临床试验总体设计及方案描述
7.1.1临床试验的整体管理情况、临床试验机构选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
7.1.2病例的纳入/排除标准。
7.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存；痰液的培养、鉴定方法；培养鉴定阴性、阳性的具体涵义等。
7.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
7.2具体临床试验情况
7.2.1申报试剂和对比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息。
7.2.2对各试验机构的病例数等情况进行总合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
7.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
7.2.4具体试验过程，样本检测、数据收集、样本的保存条件、结果不一致样本的校验等。
7.3统计学分析
7.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或其他合理方法的复核以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
7.3.2阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%(或99%)的置信区间。
7.3.3以交叉表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。
7.4讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床试验有无特别说明，最后得出临床试验结论。
(八)产品技术要求
产品技术要求应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》的相关规定。申请人应按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的有关要求，编写产品技术要求，内容主要包含产品性能指标和检验方法，并在附录中明确主要原材料、生产工艺及半成品要求。
产品技术要求中的产品性能指标应与说明书中相关内容保持一致。如申报试剂已有相应的国家或行业标准发布，则产品技术要求不得低于上述标准要求。
(九)注册检验
根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。如申报试剂有适用的国家参考品，应采用国家参考品进行注册检验，并符合国家参考品的相关要求。
(十)产品说明书
产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书一致，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地编制说明书。
1.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：
1.1试剂盒用于体外定性检测人xx样本中的结核分枝杆菌复合群核酸。
1.2简单介绍结核分枝杆菌复合群包括哪些种的细菌、致病性、感染后的临床表现，靶核酸序列的特征(名称和基因位置等)及选择依据，其他病原体(如：非结核分枝杆菌NTM)中是否存在靶核酸序列。
1.3待测人群特征介绍：具有肺结核相关体征/症状和X线检查结果的疑似结核病患者、地域要求或年龄限制(如有)等。
1.4强调：实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备相应的生物安全防护条件。
2.【主要组成成分】
2.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组份，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。
2.3如果试剂盒中不包含用于核酸提取/纯化的试剂组份，则应在此注明经过验证后推荐配合使用的商品化核酸提取/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及产品货号、医疗器械注册证号等详细信息。
3.【检验原理】
3.1对试剂盒检测的靶核酸序列进行详细描述(名称和基因位置等)，对不同样品反应管组合、对照设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。
3.2核酸提取/纯化方法、原理等。
3.3试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分(如UNG酶)，也应对其作用机理作适当介绍。
4.【储存条件及有效期】
说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复融稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等，应明确具体的储存条件及有效期。
5.【样本要求】重点明确以下内容：
5.1样本的收集：应参照《临床技术操作规范(结核病分册)》(中华医学会编著)或者《结核病诊断实验室检验规程》(中国防痨协会基础专业委员会编著)现行有效版本推荐的采样要求，并详细描述采样步骤和注意事项。
5.2临床样本的前处理(如适用)：应参考《临床技术操作规范(结核病分册)》(中华医学会编著)或者《结核病诊断实验室检验规程》(中国防痨协会基础专业委员会编著)现行有效版本推荐的前处理方法，尤其是痰标本，如碱处理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH法等，详细描述具体的前处理方法。
5.3样本的其他处理、运送和保存：明确核酸提取/纯化前的其他处理(如离心、洗涤等)、保存条件及期限(短期、长期)、运送条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否需要恢复至室温，冻融次数的限制。
6.【适用仪器】所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
7.【检验方法】详细说明实验操作的各个步骤，包括：
7.1实验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度、空调气流方向控制等注意事项。
7.2试剂配制方法、注意事项。
7.3详述待测样本及相关对照核酸提取/纯化的条件、步骤及注意事项(如适用)。
7.4扩增反应前准备：加样体积、顺序等。
7.5 PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置或相应的自动化检测程序及相关注意事项。
7.6仪器设置：特殊参数、结合探针的荧光素标记情况、对待测基因及内标的荧光通道选择。
7.7基线、循环阈值(Ct值)的选择方法或相应的自动化检测程序。
8.【检验结果的解释】
结合阳性对照、阴性对照、内对照(内标)、核酸提取/纯化对照(如适用)以及样本管检测结果的Ct值，以列表的形式对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。如存在检测灰区，应详述对于灰区结果的处理方式。
9.【检验方法的局限性】
9.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
9.2有关假阴性结果的可能性分析
9.2.1不合理的样本采集、运送及处理、样本中细菌含量过低均有可能导致假阴性结果。
9.2.2待测靶核酸的变异或其他原因导致的序列改变可能会导致假阴性结果。
9.2.3未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果(如有)。
9.3有关假阳性结果的可能性分析
除结核分枝杆菌复合群外，其他病原体可能含有靶核酸序列，因而导致假阳性，列出可能导致假阳性结果的病原体目录。
10.【产品性能指标】详述以下性能指标：
10.1对国家参考品检测的符合情况，简要描述采用国家参考品进行检测的结果(如适用)。
10.2最低检测限：说明试剂的最低检出浓度，简单介绍最低检测限的试验方法及结果。
10.3企业阳性、阴性参考品的检测符合情况，简单介绍阴阳性参考品的组成、浓度和符合率结果等信息。
10.4精密度：精密度参考品的组成、浓度及结果。
10.5分析特异性
10.5.1交叉反应：对出现在相应临床标本中可能产生交叉反应的其他病原体的验证情况，建议以列表的方式明确经过交叉反应验证的病原体名称、菌株特性、浓度等信息；
10.5.2干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如血液、粘液或药物等；
10.6对比试验研究(如有)：简要介绍对比试剂(方法)的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
10.7境外(如适用)和境内临床试验数据总结。
11【注意事项】应至少包括以下内容：
11.1有关人源组份(如有)的警告，如：试剂盒内xx组份可能含有人源物质，虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等项目的检测，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。
11.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》(卫办医政发〔2010〕194号，或现行有效版本)等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。
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