脐带间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化的安全性与有效性

脐带间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化的安全性与有效性
2016/9/6 细胞王国

     胡晴曹梦莹高畅朱文成葛林通

     【摘要】目的观察人脐带间充质干细胞(UC—MSC)治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的临床效果及不良反应。方法ALS 30例，给予UC-MSC静脉滴注联合鞘内注射治疗，每次静脉滴注约3 x 1 0 个细胞，鞘内注射约7 x 10个细胞，1次为1个疗程。采用ALSFRS评分量表及APPEL评分对患者治疗前及疗程结束后1周、1个月、3个月时神经功能进行评定，对比治疗前及治疗后上述各项指标的变化，并对患者年龄、病程、治疗前病情严重程度( ALSFRS评分)与治疗后改善程度相关性进行分析。结果治疗后1周、1个月、3个月与治疗前相比ALSFRS评分升高(P<0.05)，APPEL评分降低( P<0.05)。治疗后1个月与治疗后1周相比ALSFRS评分升高( P<0.05)， APPEL评分降低 ( P<0.0 5)。治疗后3个月与治疗后1个月相比，ALSFRS评分升高( P> 0.05)， APPEL评分降低(P>0.05)，差异无统计学意义。患者年龄、病程、性别与症状改善程度无明显相关性 ( P>0.05)；治疗前神经损伤程度与改善程度呈负相关( P<0.05)。结论US-MSC鞘内注射联合静脉滴注治疗ALS，在一定程度上可延缓病情进展，未出现严重不良反应。

     【关键词】脐带间充质干细胞；肌萎缩侧索硬化

     肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS) 为运动神经元病常见的一种类型，为病因及发病机理未完全阐明的一种神经系统变性疾病。其主要特征为选择性地侵犯上、下两级运动神经元，临床表现主要为肌无力、肌萎缩、肌强直，一般无感觉障碍及括约肌功能障碍，患者最终常因呼吸肌受累导致呼吸衰竭而死亡。该病目前尚无有效治疗方法，故寻找一种有效的治疗手段成为ALS的研究热点。

     随着生物技术及再生医学的发展，干细胞临床应用也得到了长足的进展，尤其在治疗ALS等疑难疾病方面。干细胞种类繁多，包括胚胎干细胞、神经干细胞、问充质干细胞及诱导多能性干细胞。其中间充质干细胞由于其神经细胞方向的分化潜能在中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病的治疗方面具有重要意义。脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells， UC-MSC)来源于脐带，易于获取，无伦理限制，其细胞活性、细胞数量、增殖能力均可控制，已在临床治疗与研究中得到了广泛应用。我院采用脐带间充质干细胞鞘内注射联合静脉滴注治疗ALS 30例，现报告如下。

     1 材料与方法

     1.1 一般资料 2010年7月～2011年3月我院神经科及细胞治疗研究中心收治的ALS30例，均符合1998年世界神经病学联盟 (World Federation of Neurology， WFN)提出的 E1 Escorial诊断标准；同时符合以下纳入标准：病程6个月以上，有运动神经元损害症状，感觉正常，诊断明确，已行肌电图、磁共振等检查，排除脊髓压迫症、脊髓空洞症、脊髓肿瘤、多发性硬化等疾病；无心肺肾肝等重要器官功能衰竭，无严重感染，无恶性肿瘤等疾病。其中男21例，女9例，年龄 32-68(平均年龄 50±9.48)岁，病程6～43(平均病程17.27±10.02)个月。30例治疗前充分告知患者及亲属治疗方案及风险，并均签署知情同意书；所有患者治疗方案均报医院医学伦理委员会批准。

     1.2 方法

     1.2.1 治疗前检查评估治疗前对患者进行评估，行相关检查：ECG、EEG、EMG、颅脑及脊髓MRI，血、尿、大便常规，肝肾功能，血糖，肿瘤标记物，凝血功能，以及艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒血清学抗体检测等。

     1.2.2 UC-MSC制备参考Avanzini MA等的方法，经产妇知情同意及病原体检澳0 后收集脐带，去除外膜和动、静脉，将脐带剪成0.5 cm大小的组织块，加入等体积0.2%I型胶原酶，37~ C消化过夜。次日，加入两倍体积的 0.05%胰蛋白酶，37℃ 消化1h。2000r/min离心10 min，收集细胞，计算活细胞数。将细胞悬浮于人 MSC无血清培养基中，按1×1 06 cells/cm底面积接种于培养皿中，后按操作规程进行传代培养。用流式细胞仪测定细胞表型，并检测细胞活性，培养并检测病原体，符合标准后收集细胞用于治疗。

     1.2.3 UC-MSC注射在洁净层流治疗室内对患者进行腰椎穿刺术成功后，留取脑脊液约5ml，常规送检。后缓慢鞘内注射UC-MSC生理盐水悬液5ml (内含细胞数约7×10个 )；术毕拔针，再次消毒后局部覆盖无菌纱布加压包扎；并嘱患者去枕平卧6～8h，并保持局部干燥，禁浴3d。鞘内注射完毕即静脉滴注UC-MSC生理盐水悬液100ml (内含细胞数约 3×10个)。所有患者常规治疗(如营养神经、改善微循环类药物治疗等)均相同。细胞治疗完成后患者入监护病房严密观察，如有不适给予相应治疗；如无严重不良反应，患者3d后出院，1周、1个月及3个月后复诊，随访观察1年，评估疗效和不良反应。

     1.2.4 评估标准和数据分析本研究为自身前后对照研究，采用ALSFRS评分量表及APPEL评分对患者治疗前及治疗后1周、1个月、 3个月时神经功能进行评定。ALSFRS量表评分包括语言、唾液分泌、吞咽功能、书写、切断食物、使用餐具、穿衣、卫生保健、在床上翻身、整理衣物、行走、攀登楼梯以及呼吸等项目；总分为0～40分；分值越低神经功能损害越严重。APPEL评分包括延髓功能评分 (6～30分 )、呼吸功能评分(6～30分)、肌肉力量 (肌力手法测定6级 )评分(6～36分)、下肢肌肉功能评分(6～35分)和上肢肌肉功能评分(0～33分)，共5大项、19分项；最低30分，最高164分；分值越高，神经功能损害越严重。将患者年龄、病程、治疗前神经功能损害严重程度(APPEL评分反应 )与治疗后改善程度进行相关性分析(治疗后1个月APPEL评分一治疗前APPEL评分)。

     1.3 统计学分析采用SPSS17.0统计软件包对数据进行统计处理，数据以元±s表示,采用配对样本t检验及相关性分析，以P<0.05为差异有显著性。

     2 结果

     2.1 安全性分析在UC-MSC治疗中及治疗后复诊过程中，患者生命体征稳定，未见严重不良反应发生。30例中5例在细胞移植治疗后4～8h内出现发热，但体温最高未超过38.5℃，持续时间均未超过24h，未经特殊处理均自行下降至正常；3例出现头昏、头痛，体检无脑膜刺激征及其他感染征象，经对症处理后缓解；7例出现腰部酸胀不适，未经特殊处理自行缓解。

     2.2 有效性分析 30例患者接受脐带间充质干移植细胞治疗1次(共1×10个MSC)，在治疗后1个月，部分患者(76，7%， 23/30)肌萎缩、肌力、语言功能、吞咽功能、呼吸功能均较治疗前有所好转，生活质量较治疗前改善。从表1中可以看出，治疗后1周、1个月、3个月与治疗前相比， ALSFRS评分升高，APPEL评分降低，差异有统计学意义(P<0.0 5)。治疗后1个月与治疗后1周相比，ALSFRS评分升高，APPEL评分降低，差异也有统计学意义 (P<0.0 5)。治疗后3个月与治疗后1个月相比，ALSFRS评分升高， APPEL评分降低，差异无统计学意义(P>0.05)。

     将患者年龄、病程、性别分别与治疗改善程度(治疗后1个月ALSFRS评分一治疗前ALSFRS评分)做相关分析，见表2，患者的年龄、病程、性别与治疗改善程度均无明显相关(P>0.05)，治疗前神经功能损伤程度与治疗改善程度呈负相关 (r= -0.541，P< 0.05)，症状越重，治疗后改善越轻微。



     3 讨论

     肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)为运动神经元病的一个亚型，自1874年被Char-cot报道以来，该病的病因、发病机制、诊断及治疗方法均受到医学界的广泛关注。关于ALS的病因曾提出许多学说，包括自由基氧化损伤学说、兴奋性毒性学说、骨骼肌异常学说、自身免疫异常学说、神经营养因子及环境因素影响等，但确切的病因目前仍没有定论【6.7】。病理诊断ALS的标准是，运动皮质的大锥体细胞消失，脊髓前角和脑干的运动神经元脱失，并出现异常的细胞病理改变，皮质脊髓束变性和脱髓鞘。由于皮质、脊髓运动神经元变性导致ALS患者产生相应的临床症状及体征。ALS患者的症状主要表现为下运动神经元损害之表现，如疲劳、力弱、肉跳和动作不协调等；查体可见肌肉萎缩，肌力下降，中重度肌张力降低，腱反射减弱，真性延髓性麻痹，肌肉痛性痉挛，以及肌束颤动等。其中舌肌纤颤是一个高度提示ALS的体征。上运动神经元损害的表现为力弱、动作不协调、僵硬和肢体远端动作减慢等，体征为运动技巧性降低、肌力减退、轻度肌张力增高、腱反射增强、假性延髓性麻痹、伸肌痉挛，病理征如Babinski征和Hoffmann征阳性等。患者起病时症状通常不对称，病情常在不断进展中导致肌肉萎缩、肢体痉挛，最终累及呼吸肌导致呼吸衰竭而死亡。对于ALS的治疗，有研究认为力如太(氨基-2-三硫甲氧-6-苯并噻唑)，能抑制谷氨酸的神经毒性作用，可稍为延缓该病的进展速度，但该药物并不能阻止病程进展。

     干细胞是能自我复制和并具有多向分化潜能的原始细胞，利用干细胞修复损伤组织及促进其功能恢复，是目前医学研究的热点之一。间充质干细胞 (mesenchymal stemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，具有多向分化潜能，尤其能向神经细胞方向分化，在治疗神经系统疾病方面具有广阔的前景。目前间充质干细胞的来源包括：骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。骨髓MSC含量低，患者要经历采髓过程，有创伤和一定的的痛苦，并有一定的危险性，需要大约21d的体外培养扩增，病人不能及时接受细胞治疗而须较长时间等待。人脐血中含有MSC，但传代培养困难，不易大量获得。而人脐带沃顿胶(Wharon’S jelly)含有丰富的MSC，在体外能够大量扩增，短时间内即可收获足量的细胞以满足临床治疗需要。更为重要的是， UC-MSC是一种低免疫原性的细胞，这为利用异体UC-MSC治疗神经细胞损伤性疾病提供了可靠的基础。干细胞治疗ALS的可能作用机制主要包括3种：细胞替代、神经营养因子释放和免疫调节。现有大量的实验研究表明，间充质干细胞有很好的可塑性，能在体内分化为神经元细胞及胶质细胞，能在被受者的中枢神经系统中对神经元进行识别和连接，从而替代运动神经元作用，恢复运动传导。目前研究发现的具有神经保护作用的营养因子很多，近年来大量的文献报道，在实验室将干细胞移植到神经变性病模型中，多数实验观察的有效效果并非来自细胞替代，而是来自释放出的神经营养因子，甚至有研究人员认为干细胞治疗有效不是因为直接的神经元替代，而是由于干细胞分化为胶质细胞样细胞，为运动神经元提供营养因子”。而免疫调节作用主要表现在抑制炎症反应，也存在文献报道干细胞在病变组织中可减少神经损伤后炎症反应，减缓 ALS进展。

     目前有研究者报道，间充质干细胞治疗ALS患者均取得了一定的疗效，认为间充质干细胞治疗ALS疗效肯定，安全可行。在我们的研究中，采用了us- MSC细胞悬液鞘内注射联合静脉滴注治疗ALS，其中部分患者(76.7%，23/30)肌萎缩、肌力、语言功能、吞咽功能、呼吸功能均较治疗前有所好转。ALS患者治疗后1周、1个月、3个月的 ALSFRS评分均较治疗前升高(P<0.05)， APPEL评分较治疗前降低(P<0.05)，差异具有统计学意义，提示患者在给予间充质干细胞治疗后病情较前明显好转，生活质量有所提高。治疗后3个月与治疗后1个月相比，ALSFRS评分升高(P>0.05)， APPEL评分降低(P>0.05)，但差异无统计学意义。提示患者在治疗后3个月时病情稳定，未出现明显进展。在对改善程度相关性分析中可以看出，患者的年龄、病程、性别均与改善程度无相关性，但治疗前 ALSFRS评分与改善程度呈负相关(r= 一 0. 541， P<0. 05)，提示患者治疗前神经损伤程度越重，改善程度越差。由此可推论神经系统尚存的未完全坏死的运动神经元可能是间充质干细胞治疗好转的基础，提示早期进行细胞治疗效果较好。

     脐带间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化的不良反应主要为～过性发热、头昏、头痛、腰痛，未见严重不良反应发生。上述不良反应均在鞘内注射1～2d内发生，经相应处理后缓解，后期未见严重不良反应发生。

     通过对上述研究初步表明，US-MSC鞘内注射联合静脉滴注治疗ALS是安全、有效的方法，在干细胞移植后一定程度上可延缓病情发展。但细胞治疗的远期疗效及安全性仍需进一步观察；每一疗程的细胞治疗次数、每次细胞治疗数量、治疗时间间隔、最佳给药途径、药物对移植入体内细胞的影响等均需深入研究，其作用机制也尚待揭示。

     参考文献：

    http://www.duyihua.cn
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