国外植入前遗传学诊断指南解读
2016/4/28 医学界妇产科频道

     作者:刘东云,黄国宁

     来源:《中国实用妇科与产科杂志》

     1990年世界首例植入前遗传学诊断(PGD)试管婴儿的出生标志着人类辅助生殖技术的突破性进展。近十年来,随着单细胞全基因组扩增技术及分子遗传学诊断技术的发展,植入前遗传学诊断技术得到迅速发展及广泛应用。2008年PGD国际协会(PGDIS)公布的数据显示,可进行植入前遗传学诊断的单基因疾病种类约170种。目前国内尚缺乏植入前遗传学诊断技术规范,为此,本文以“consensus”or “guideline”, and “PGD” or “PGS”为关键词检索了2010年至今的关于国外植入前遗传学诊断技术规范或指南相关文献,并就此解读。

     1、国际PGD指南概况

     成立于2002年10月的PGDIS 2004年颁布了PGD技术指南(PGDIS, 2004)。并于2008年修正了PGD操作流程及实验室质量保障指南,就PGD实验室建立、标本取材、诊断技术、胚胎移植、质量控制与保障、遗传咨询与随访等提出了建议。欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD联盟就PGD实验室的设立及相关的3项技术:DNA扩增技术、荧光原位杂交(FISH)技术、胚胎活检建立了相关指南。2015年,Tur-Kaspa等提出了用于HLA配型的PGD指南,有助于指导PGD技术在选择与罹患血液系统疾病、急需脐带血干细胞(骨髓)移植患儿的父母选择HLA配型符合的胎儿中的规范应用。作为高加索人群中最常见的单基因遗传病,囊性纤维瘤在欧洲人群中的患病率为1/4000,Girardet等2015年则提出了囊性纤维瘤PGD指南,可作为单基因病PGD技术指南参考。这些指南有助于规范PGD技术,并建立符合中国国情的PGD技术规范和指南。

     2、PGD实验室建立指南

     PGDIS建议应根据ESHRE Embryology Specail Interest Group 的推荐建立合理的IVF实验室及高效的PGD实验室。PGD流程中包括胚胎培养、胚胎活检、细胞固定、细胞DNA扩增、荧光原位杂交、基因测序、胚胎移植等诸多环节,各实验室应建立充分的信息交流,并遵循严格、一致的质量控制标准。所有实验室操作流程应记录在一本操作手册上,实验室负责人应及时更新操作手册,并确保每一位相关工作人员掌握最新的操作流程。这样才能保证治疗结果的一致性。PGD过程中,胚胎活检、胚胎的独立培养、根据PGD结果选择可移植胚胎是最重要的3个环节,须双人审核。PGD实验室应能够同时开展包括FISH和聚合酶链反应(PCR)的单细胞遗传学分析与诊断技术。

     因为极体活检、卵裂期胚胎活检和囊胚活检都可用于PGD,所以PGD中心必须有经过正规培训的胚胎学工作人员熟练掌握并长期操作上述技术,即使上述活检技术不是在每一个PGD中心都常规开展。PGD实验室建立过程中应格外注意避免外源性细胞或DNA污染活检细胞,外源性DNA污染包括来源于操作者导致的污染等。严格遵循PCR实验室操作规范。基因扩增前的操作应在独立的区域且在超净工作台下进行,PGD分析应能检测出母源性及父源性DNA污染的可能性,否则存在较高的误诊风险。活检后的细胞应在相邻的独立区域进行细胞固定(用于FISH)或全基因组扩增(用于PCR)。标本的标记和识别是一个高风险环节,在细胞固定或转入PCR反应管时、胚胎诊断及诊断后对应胚胎这3个环节上必须经过双人审核与认证。国内外都有很多生殖中心将活检后的标本外送至特定的检测公司或实验室进行诊断,此时必须在生殖中心与检测实验室之间建立严格的标本运输与接收、标记体系,同时应明确双方权责。生殖中心和检测实验室之间应就法律、保险和责任签署正式合同。建议生殖中心和检测实验室共同使用联合知情同意书。生殖中心进行的细胞固定或转入PCR反应管的操作需要得到检测实验室的结果认可后方可施行临床标本检测。

     3、胚胎活检技术指南

     可用于PGD的细胞来源包括卵子极体、卵裂期细胞、囊胚滋养外胚层细胞。不同来源的细胞可进行不同目的的PGD,极体活检主要用于检测卵子非整倍体及母源性遗传病,不能检测父源性遗传性疾病,目前国内几乎没有生殖中心采用极体活检。卵裂期及囊胚细胞可用于几乎所有的PGD。

     胚胎活检可通过机械法、化学法、激光法在透明带开孔。PGDIS建议只能在透明带上开一个孔,以避免细胞丢失或胚胎孵出时嵌顿于透明带开孔处。应避免开孔过大(>60μm)、过度挤压胚胎、激光能量过高,上述操作均可能损伤胚胎。

     活检培养基使用与胚胎培养相同的培养基,除了Ca

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