一个创新药物的塑造过程
2016/6/30 经纬传奇

    

     写在故事之前

     早晨上班的路上，Lilly问我能否帮助她查阅一些资料，关于LogP和LogD。我当然爽快的答应了，我最喜欢和这种能“提出问题”的人交流，暂且不管问题大小，有欲望，才有学习的动力，这也是我会为之倾其所有的原因。

     接下来的几篇科研杂记写给这位最亲爱的同事和“领导”，彼此相互熟悉一下手里的工作，也可以静下心来琢磨一番“工作为什么要这么做？药物为何要这样设计和筛选？”。

     主要内容参考自：

     Drug-likeProperties: Concepts,Structure Design and Methods: from ADME to Toxicity Optimization(By Edward H.Kerns and Li Di)

     这本电子书来自一位年轻的朋友，当时我们彼此分享了手里的资料，这种感觉很好，相互学习，共享资源，在此对他表示感谢!

     谈到药物，我们都很熟悉；谈到如何设计药物，就不好回答了，case-by-case；谈到手里的工作是为什么而作，感觉是一件容易回答的问题，其实不然，很多人不知道其中缘由，只是工作而已，其中也包括我自己。我是带着许多疑问搜索一些自己需要的消息，临床的研究暂且放在一边，若是能在今年8月份之前能搞清楚临床前的药物研究，也不愧于在Pharmaron工作两年。关于ADEMT，公司有大把的专家，小弟在此班门弄斧了，还请阅读此文的同事指正。

     一，概念介绍

     曾有人在公司内报告过关于Drug-like的故事，现在没有多少印象，多半是因为当时很多知识并不了解，无法真正体会其中含义，要么就是药物研发领域实在是过于庞大，一般需要了解一个化合物的诸多特性才可进入临床试验：如结构的特征，包括分子量、氢键结合、极性、构型、亲脂性、pKa等；物理化学特征，包括溶解性、渗透能力、稳定性等；生化特征，包括代谢过程(I相和II相)、蛋白结合能力、转运(吸收和排出)等；PK(Pharmacokinetics，可以理解成化合物在动物体内的表现)和毒性特征，包括清除率、半衰期、生物活性，药物间相互作用(DDI, drug-drug interaction)、LD50等。这里面的每一项都有很多故事，有许多细节先保留，日后有需要的地方再做解释。

    

     Overviewof drug research anddevelopment stages and their major activities.

     对于一个新的小分子化合物，简单说需要药物研发(Discovery)和临床药物开发(Clinical Development)两大部分，获得FDA批准后再进入临床应用(Clinical Application)阶段，而我们的工作主要集中在Discovery部分。在早期的药物研究中，临床前的研究并不是很深入，规则也缺乏合理性，这就造成了许多化合物进入临床后多有疗效不佳、副作用明显等问题，最终只能提前终止临床试验或者后期被撤回。

     1988年有篇paper描述了药物失败的原因，有39%左右的化合物失败主要由于他们的生物制药学特性不够好(主要是PK和生物活性,bioavailability)。(Prentis,R. et al.,(1988). British Journal ofClinical Pharmacology, 25, 387–396)

     渐渐的人们意识到临床前研究的重要性，不仅能节约成本，还能加快药物的研发速度。ADMET(absorption, distribution, metabolism,excretion and toxicity)就是在这样的背景下成为了如今药物研发过程中重要的模块之一。相关实验获得了诸多的实验数据，也就绘出了一个化合物的特性(Drug Properties)。也是由于该领域的快速发展，使得药物研发失败的比率在2000年降低到10%。(Kola, I. and Landis, J. (2004).NatureReviews Drug Discovery, 3, 711–716)，现今更是加快了药物研发的速度和准确率。

    

     Stages of drug discovery,primarygoals, and major activities.

     从前人们更关注化合物对靶点的结合和功能，也就是活性(Activity)，经常寻找SAR(structure-activity relationships)，合成大量的化合物分子，希望从HTS中获得IC50为μM级甚至nM级的化合物。

     其实物极必反，如果规则过于单一，筛出来的不一定是“优秀的人才”(这也是多年以前上头提出的素质教育的原因嘛，容易理解)。例如水溶性太高，可能通不过血脑屏障(blood–brain barrier，BBB)，无法达到位于CNS(中枢神经系统central nervous system，not Cell, Nature and Science)的靶点，溶解性太低可能不易被小肠吸收等，所以现在人们更倾向于兼顾特性(Properties)，为了达到某种平衡，以获得更好的疗效。

     如今有一种新型的筛选方式为SPR(structure-property relationships)，算作对SAR的补充：一方面利用SAR(一种structure-based design)设计出高亲和力的化合物，再利用SRP(一种property-based design)的方式得到能顺利通过各种屏障、达到靶点的化合物。

    

     Pharmaceuticals balance activityandproperties

     (From Kerns (2002). Current Topicsin MedicinalChemistry, 2, 87–98)

     现在来说说化合物达到靶点位置需要翻过哪些大山、经历哪些磨练。

     简而言之，对于口服的药物入口之后，若停留时间够长，会有稍许通过粘膜吸收。大部分药物入胃，需要停留0.5~1h并且要耐得住pH=1.4~2.1的酸性条件，到小肠后需要尽量被吸收(之前的两个项目涉及的是non-systemic drug，就是作用在小肠吸收的位置，不需要被吸收进入血液循环)，之后开始随着血液在体内开始循环，这就好比药物真的离开了“乡村”进入了“都市”，这里面会发生很多故事，有许多地方是他们无法预料的。比如药物会通过肝部代谢，有很多酶在哪里等着药物，经过这番洗礼后药物还要进入靶点，到达那里的时候不知有多少药物兄弟已经丢失。下面可简单介绍几个屏障：

     GI Tract

     食物离开胃以后进入小肠，先后经十二指肠(Duodenum)、空肠(Jejunum)和回肠(Ileum)，此“路段”的pH值成逐渐升高的趋势，由4.4渐渐升高到7.4~8，这里涉及到pH的梯度，估计也是后面需要计算LogP和LogD的原因，因为后者是随着pH值而变化的。

     这里药物的溶解性(solubility)就是一大关键，因为酸性和碱性化合物的pKa和环境中的pH值会对其有很大影响，这可以直接用化学的酸碱电离的理论解释。食物进入小肠的过程中也会伴有胆汁的存在，胆汁来自胆囊，其中的胆酸有利于亲脂性化合的溶解和吸收；在回肠阶段胰液会带来许多酶类(如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶)，会对一些药物进行水解反应。食物和药物在小肠内部存留的时间较长(2~4h)，其内壁千回百转，主要是更好完成吸收营养的过程，这个过程需要透过小肠绒毛、两次穿越小肠壁细胞膜，到达毛细血管，参加血液循环。在这里，就会遇到我常常听说的化合物穿越细胞的几种方式：自由扩散(passive diffusion)、内吞(endocytosis)、细胞间转运(paracellular transport)、吸收转运(uptaketransport)和外排转运(efflux transport，主要依赖Pgp, P-glycoprotein)。

    

     Diagram of the GI tract

     Bloodstream

     跟着感觉走，在血液中应该是化合物扩散的最好方式，只是这里有些细节不可忽略：酶的水解反应、血浆蛋白的结合和红细胞的结合。这里的每个过程都会影响自身不带电荷的药物，降低他们渗透到组织的量。

     血液里有着大量的酶，比如胆碱酯酶(Cholinesterase)、磷酸酶、醛酸酶、葡萄糖醛酸酶、脱氢酶等等，设计化合物时要考虑到他们在血液中的稳定性，这里主要的反应依然是水解。

     PPB(plasma protein binding)，曾经听到一个报告好像提到他们有新的算法，显示PPB已经不是太关键的问题。之所以要考虑到化合物和蛋白的结合，因为血浆中约6~8%的成分是蛋白质，若是相对较小的分子“粘”在了这些蛋白质上，将会损耗相当一部分有效剂量。平常主要考虑到的几个蛋白包括清蛋白(albumin)、α1-酸性糖蛋白(α1-acidglycoprotein)和脂蛋白(lipoproteins)；与红细胞的结合主要靠化合物和细胞膜的亲脂作用。

     Liver

     肝脏是要去清除药物最主要的两大器官之一，在这里的两大阻碍主要有：代谢和胆汁萃取(biliary extraction)。药物从肝门静脉进入肝脏后，就走进了“迷宫”，这里都有密密麻麻、非常细的血管，之后药物会达到静候已久的肝细胞手里，在这充斥着成“阵列”状的代谢酶，会对药物进行多种修饰和改造，比如氧化、还原、水解等。这种改变化合物结构的过程称为 I 相代谢，主要是氧化反应。

     之后会转移一些极性基团或其他底物到氧化的位点，称之为 II 相代谢(这就是Lilly主要的工作，她所要分析的就是药物在肝细胞或其亚细胞组分中的代谢情况)，会影响到化合物的生物活性；肝细胞附近静静的流动着胆汁，一些亲脂性较高的药物会随之而去，还有一些药物经胆小管表面的P-gp转运蛋白主动运走，再经胆囊一同排到小肠内，最终跟着粪便排到体外，这些药物就是“可惜的一代”，未能到达目的地(这与药物的特性有关，比如转运蛋白亲和力、稳定性等)。

     Kidney

     另一个主要清除药物的器官，经过此地的药物和一些代谢产物会渗透到尿液中排除体外，肾单位(nephron)是主要的作用单元，在肾中有成千上万的成员。第一步清除是过滤，约有10%的肾血流量会穿越肾小球(glomerulus，内部有大量的毛细血管)。

     看着这个过程都会觉得生命就是一种奇迹，怎么会有如此复杂、高效的部件？这里的肾小球囊(Bowman’s capsule)、近端小管(proximal tubule)和远端小管(distal tubule)同时扮演着一种排泄和回收的作用，就好比一种工具摆在那，就可以行使过滤的功能，他们会帮助机体选择性回收有用的物质，比如葡萄糖、蛋白质和一些K、Na离子等，清除体内的代谢产物、毒物和废物等。一般来说，血液中的代谢产物要比原药更容易被排出，因为他们具有更高的极性，更容易经尿管、膀胱排出体外。

    

     Diagram of drug extraction in thekidneynephrons

     Blood-to-Tissue、Tissue and others

     经过以上几个地方的筛选之后，能到达组织的化合物已经算的上“人才”了，只是距离“精英”还有一墙之隔。在一些器官中存在特有的紧密结构，阻挡血液中的物质混进来，比如大脑、胚胎、睾丸等对机体有特殊作用的器官。

     所谓的障碍，无外乎也是由细胞构成，只是细胞的紧密程度不同个，细胞的选择吸收各异，这里的自由扩散现象较少，多数是主动运输；还有一种更悲催的事件就是化合物到达了非靶点的组织，这不仅整体稀释了化合物的工作浓度，而且会造成诸多“off-target”的副作用。一般说来依据化合物本身的特性可初步预测其在组织内的分布情况，比如亲脂性的药物多会停留到脂肪组织、酸性的化合物积累在肌肉(pH~6)。

    

     Overviewof in vivo barriers

     一个化合物入口后要经过如此复杂的步骤才能达到靶点，如此简单的图，若是没有大量的实验支撑是难以绘制的。如何在体外分析化合物的特性？如何筛选？如何优化？我不是很喜欢关注工作外实验技术的细节，以为不从事具体的工作还不至于如此下力的去深究，为了她还是再看一看吧，毕竟这里面也不乏有趣的故事。我比较关心的是人们如何是如何发现这些细节？有时如何建立体外的评估体系？这么多年有怎样的变化？对于门外汉讲总是喜欢从简入手。

     二，理化性质

     从前只是大概知道药物需要有适当的亲水性和亲脂性，合成药物有化学部分，筛选药物通过ADMET标准化的方法就行，其实这和不知道没什么区别。想知道一些行业的规则、手段，不得不去研究一下细节。还是试着探探水深，扒开皮看看里面都有什么货色。

     曾经我问过AZ的一位PI，想知道了解一个化合物的属性，先从哪里入手？在评价体系中是否有先后顺序？如何筛选？

     接下来让我先从最重要、最想知道的地方开始，(只能说简单的)介绍一下亲脂性、溶解性和渗透能力，从现在开始我们可以假设在人工制造一个“特务军队(大量的小分子化合物)”，要将他武装起来，送到人体内的靶点处。

     人们总结了过去多年来的药物合成和筛选经验，总结若干个规则，最为流行的应属Lipinski Rules(Lipinski, C. A., etal.,Advanced Drug Delivery Reviews, 23, 3–25)。她在Pfizer内部应用几年后才公之于众，如今也称为“5规则”，因为这些可参考的指标统一并简化了人们评价化合物的方法，简易、有效、意义非凡。

     主要描述了吸收和渗透能力较差的化合物所具有的通性：>5个氢键供体(OHs，NHs)，MW>500，Log P>5(或者MLogP>4.15)，>10个氢键受体(Ns，Os)，生物学中的转运蛋白的底物例外。

     我对化学不敏感，不太了解如何快速的通过这几个指标衡量一个有结构的化合物，既然是广泛的经验，暂且先学会接受并使用吧，毕竟超过这些规则的化合物要么不容易被吸收，要么水溶性不好，要么太大不利于渗透等等。其实这只是几个最基本条件，满足此类条件的化合物如星星般是数不清的。

     另一个较为流行的规则是Veber Rules(Veber, D. F., et al.,Journal of Medicinal Chemistry,45, 2615–2623.)，主要通过结构分析了大鼠中口服药与生物利用度相关的特性，比如可转动的键≤10、极性表面积(polar surface area, PSA)≤140 平方? 或氢键总数≤12等。

     此外还有很多其他规则，针对不同的特殊情结有了个别的经验，比如怎样应对血脑屏障(BBB)、还有“Lead-like Rules”、如何设计更potent的化合物等等，很有趣。如何应用我想多半是Chemists的事情，我就不多献丑了。

     Lipophilicity

     这里才是Lilly最开始想问我的Log P和Log D应该出现的地方，亲脂性对药物的ADMET特征比较关键，直接影响药物在体内的生物利用度。评价的方法就是分析一个化合物在极性溶剂和非极性溶剂间的分布，通俗些讲有点像看看化合物是喜欢在“油”里还是喜欢在“水”里，进入身体后是喜欢待在“脂肪(酸)”还是更喜欢进入“血液”，是否能穿过细胞膜等。Hansh和Leo阐述了一个简单的方法，可以计算药物的亲脂能力。(Hansch, C., et al., (1995).Exploring QSAR. Fundamentalsand applications in chemistry and biology)

     选用辛醇(Octanol)作为非极性相，水溶液(aqueous buffer)作为极性相，化合物进入这两相的混合之后会趋于一个平衡，通过测量各相中化合物的浓度，用如下方式分析：

     Log P=log[Cpd(o)]/[Cpd(aq)],pH保证化合物呈中性(未发生电离，估计和pKa有关).P=partition coefficient

     Log D=log[Cpd(o)]/[Cpd(aq)],pHx. D=distribution coefficient

     二者在已知pH的情况下是可以转换的，Log P对于一个化合物而言是常数，在0~3之间的化合物为好。现在知道他们是做什么的了，也知道如何计算了，也能猜出他们的值随着pH的变化，也就知道口服的药物在GI tract内的梯度pH的环境下可能会如何分布和溶解了。进入体内后若是知道各个器官、组织、障碍的结构，多半也能预测到化合物倾向于分布在什么地方，是否能通过特殊的障碍等(瞬间觉得人们是真聪明!)。一般而言，Log P主要与有化合物的分子体积、偶极性、氢键的酸碱性等有关。

     pKa

     最近才意识到，K相关的量对于一个化合物而言都是一定的，怎么从前没有意识到呢？pKa用来表示电离能力，是评价溶解性和渗透性的主要参数。当pH=pKa时，化合物的中性状态和电离态的浓度相等(如果能理解水的电离和pH的计算就很好理解了)。

     一般情况下，处于电离态的化合物更容易溶解于水相，在衡量化合物的溶解性时也会考虑到中性情况下的溶解能力(主要的溶解方式还是电离后的化合物)；与此对应，电离后的化合物渗透能力不高，因为需要透过细胞膜，这和亲脂性成正相关。这个时候就要结合靶点和给药方式折中选择一个化合物的pKa了，任何一面达到至善，另一方面就不会过关(是不是有点像量子力学中的不确定性原理？是否有中庸的影子？)

     Solubility

     每次溶解和稀释新的化合物时，我们都会先看看是否好溶，与易溶的化合物相比，溶解度低或粘度高的化合物很容易被发现，不仅在体内这样的化合物不是首选，在做体外实验时也经常让人头疼。

     溶解性是指一个化合物在指定溶剂中的最大溶解浓度，一般决定化合物在小肠的吸收和生物活度，会随着离子化的程度而升高，与Log P和MW成反相关，一般盐的形式会提高溶解性。可想而知，溶解性低的化合物不仅不利于吸收，静脉注射的效率也会很低，在体外的实验中活性不高且数据不稳定，这样的化合物一般不适合推向临床试验。Lipinski等人认为一个化合物的溶解性要比渗透能力更为重要。

     和溶解性相关的因素比较多，一方面来自化合物本身的化学特性，一方面和溶液条件(体内环境)有关。如今许多化合物可以依据其结构信息(如亲脂性、大小、pKa、晶格能等)分析预测其溶解能力[Log S=0.8-LogP-0.01(MP-25)]，MP=meltingpoint，根据此公式可算出当Log P增加1个单位，MP提升100oC，溶解性S会下降10倍(在Chemist手里有很多办法可以提升化合物的溶解性)。

     关于溶解性还有两个概念我感觉很有意思：热力学溶解(thermo dynamic solubility)和动力学溶解(kinetic solubility)。

     前者就是我们通常认为的化合物的溶解达到平衡后的溶解能力，后者一般是将溶解在有机溶剂中的化合物加入到水溶液中再检测溶解性，一般可用HPLC-UV 或LC-MS/MS技术直接测量化合物的溶解度。

     一个化合物的不同晶体结构的热力学溶解度是不同的(比如非晶形的、晶状的、多晶型、水合物、溶剂型等)，高能晶体化合物(较不稳定)的溶解性一般比低能的高，这也就暗示在不同的合成批次和方法中，一个化合物的热溶解性各异；另一种情况说明的是化合物从有机溶剂中加入到水溶液时，有很多情况下并不能快速达到平衡，比如我们常常用DMSO溶解化合物，加入到Assay中的水溶液时，时而发生析出的现象，这些化合物处于一种亚稳定(metastable)晶体形式(通常有不同的晶格结构)，了解此过程利于顺利的进行biological和property assays。(可参考Thermodynamicvs. KineticSolubility: Knowing Which is Which, Harry G. Brittain, Ph.D. April29, 2014)

    

     Solubility,permeability, andmetabolic stability affect oral absorption and bioavailability

     药物的最大吸收剂量(maximumabsorbance dose, MAD)指的是药物在一定浓度的情况下被机体吸收的最大剂量，其中与药物的溶解性、渗透能力、在小肠内停留的时间等因素相关。一般说来，10–60 μg/mL的溶解性适宜，两边则偏低或过高。对于不同的给药方式和剂量，对溶解性的要求也会随之而变。

     Permeability

     指化合物穿过膜结构时的速度，与小肠吸收和生物利用度有关，一般通过优化化合物主动运输特性、提高Log P、降低分子大小和极性来获得更高的渗透能力。化合物在体内有多重步骤需要透过细胞膜才能达到靶点，比如GI的表皮细胞、毛细血管壁、肝细胞膜、肾小球、进入一些有限制性障碍的器官、靶点细胞膜等，这些突显出此特性在药物研发中的重要性，在体外的生物筛选试验中也需要优先考虑。

    

     Major permeability mechanisms.

     (From Di, L., 2003, Kerns, EuropeanJournal of Medicinal Chemistry,38, 223–232.)

     化合物透过细胞的方式有多种，其中最为主要的应属被动扩散(也是自由扩散，就是化学中的布朗运动，在病毒学中曾经以为病毒颗粒的亚组分是自由扩散的，其实不然，人家是由专门的运输机制)，这主要与膜内外的浓度差有关，所以在小肠的表皮附近浓度较高的药物会很容易的透过小肠进入血液循环，之后是一个不断被稀释直达整体平衡的过程，这个时候pH和pKa就是需要考虑的因素了。曾有文章显示有95%的药物主要在GI tract通过这种方式被吸收，有时药物也会结合转运蛋通过小肠壁，只是这种情况也有饱和的时候，效率不比被动运输。

     在体外评价该过程有个常用的方法，就是PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay)；内吞和转运也影响药物的渗透能力，只是有限，适用于少部分药物的研发。去年在公司听过一个报告，好像是在药物的尾巴上加上一个多肽还是二肽，专门利用小肠细胞表面的一个转运受体，能够提升药物的吸收；对于较小的极性分子，也可直接穿越细胞间的空隙被吸收。

     与此同时，也存在几种外排转运(effluxtransport)的蛋白，常见的有P-gp和BRCP(breastcancer resistance protein)，他们主要是降低细胞内药物的浓度。这些蛋白也存在于细胞膜上，比如BBB处外排转运有利于保护脑部存有过量的化合物，在肝细胞中可以清除化合物和代谢产物，在神经元中也有P-gp的身影。于是在考虑药物渗透能力的时候，需要综合衡量进入和外排，在不同的组织、器官也会有所差异，着实为一件很复杂的事情。

     有一个分类方法简单又好用，就是BCS (Biopharmaceutics Classification System)，根据溶解性和渗透性分成4类：

     类化合物具有双“高”，这是最适合口服药的特性；

     类是低溶解、高渗透，这类化合物就需要Formulation(不知是否可以译为“制剂”？)来提高溶解性；

     类是高溶解、低渗透，这类化合物一般是前药(Pro-drug)，需要继续优化；

     类被放弃的居多，不太适合投入太多时间和精力。

     对于药物研发过程来讲，除了以上两方面以外，还需要考虑药物在体内的代谢、清除率、稳定性、PBB、转运等等，需要一遍又一遍的优化，才能拿到几个活性较好的1类化合物。

    

     Biopharmaceutics Classification System (BCS) for in vitro/in vivo (IVIV) correlation

     (右上角的“High Solubility”应该是“Low Solubility”)

     到了这里依旧是概况，太多的细节在后面，还有很多故事未曾提及，听着Big Pharma的同事讲述一个药物的研发历程，可以在45min内搞定，只是这个药物或许已经走了十年的历程，风风雨雨，起起落落，直到最后依然屹立不倒的才能来到大众眼前。我现在还想了解一些关于转运、受体、靶点、机制的信息，一些常见的参数、熟悉的缩写，还有一些现在工作涉及的方法、原理等等。路漫漫，趁着近期还有些时间，再钻进去看看。

     三，转运, 代谢及安全性

     有人问我：工作之余你喜欢做什么？

     要是细细数来，工作之余我会做很多事情，如果说喜欢，就是多花一些时间在某个问题上，而不是professional，眼下我喜欢接触新知识(多半与Science相关)和回味历史(人物和故事)，也喜欢和懂得讨论和分享的人们交流。

     与其说中午zizz一会，还不如利用这会安静的时间，接着搜索一些自己感兴趣的话题。曾经看过一个无聊的电影，但片尾的一句话让我难以忘记：“拳打千遍，其意自现。”很多时候只有真的投入其中，你才会发现自己是否喜欢一件事，否则喜欢也只能称其为一时的感觉。

     下面还是接着看看Drug Discovery的相关概念吧…

     Transporters

     既然有Trans，就感觉这里的转运有着两面性：一个是进入(influx)，一个是外排(efflux)，她们与药物的吸收密切相关，在许多体内组织中都有足迹。之前提过药物被吸收主要是自由扩散的作用，对于一些特别的、稍大的营养物质还是需要转运蛋白的辅助，比如向内转运寡肽的PEPT1和PEPT2、转运有机离子的、胆酸的(NTCP)、核苷酸的、葡萄糖的(GLU1)的转运蛋白等，外排的如之前提到的P-gp和BCRP。

     一般说来，转运蛋白的工作需要消耗机体的能量(ATP)，不过这些都是值得的(虽说少部分反应目前看来是累赘，不过我的直觉告诉我机体内的生化反应绝大多数都是值得的，人们需要认识这其中的规律与意义)。

     考虑到发生转运的位置不同，比如小肠、肝细胞、肾、BBB等，药物的主动转运一般会影响体外ADME/Tox和体内PK的性征，通常有与天然底物具有相似结构的化合物更容易被转运、与转运蛋白亲和力高的机会也更大。若两种化合物需要利用同一个转运蛋白，还需要考虑DDI (Drug-drug interaction)。

     此外，细胞表面的转运蛋白的数量也是有限的，这也就会出现转运饱和的现象，一个好的化合物会充分利用influx transporter，避开efflux(市面上许多药物是转运蛋白的底物)。目前已经发现了许多转运蛋白，新的成员也在逐渐增加，这里面最为重要的应属“P-gp”。

     顾名思义，外排作用的转运蛋白主要是将化合物运到细胞外面，他们属于ATP结合蛋白(ATP-binding cassette family, ABC)。P-gp，170 KD，1280 aa，12跨膜结构域。化合物结合到它的结合区域时，细胞内结合并水解2个ATP分子，蛋白发生构象变化，化合物即被转运到细胞外侧。

     早期人们用化疗治疗癌症时，发现许多癌细胞接触药物后开始死亡，只是少部分细胞得以存活并扩增。后来人们发现P-gp在这些癌细胞中过表达，当时人们认为它是癌细胞对多种不同结构的药物产生抗性的主要原因。经过肿瘤学家的数十年的研究，揭开了该蛋白在药物研发中的作用，并发现它在体内多处表达，如BBB、大小肠、肝、肾、肾上腺和子宫等地方，主要起到保护机体的作用，这也是人们在设计此类靶点的药物时不得不考虑P-gp的作用。

    

     Schematic diagram of P-gp

     可能底物：N+O≥8, MW>400, Acid with pKa>4

     非底物：N+O≤4, MW<400, Base with pKa<8

     关于向内转运的蛋白人们关注力明显不如P-gp，哦想起来了，之前一次的报告讲述的就是二肽或三肽的转运蛋白(Di/TriPeptide Transporters)，PEPT1和PEPT2，加入结构较小的肽会提升化合物转运的机会，增加生物利用度。曾经Ganciclovir口服后生物利用度仅有6%，连入一个二肽便提升到61%，实验证明这样的改变是由于PEPT的作用。

     BBB(Blood-Brain Barrier)

     只要涉及到大脑，神秘的地方太多，很多无法理解，可是事实确实存在。“中枢”二字，同意重合有强调之意，“中”和“枢”都有居中、重要、秘密之意，放在一起形容CNS确实很恰当(神经系统和行政部门、军队建制等地的功能非常相似)，多少能理解在此处用药的难处。

     CNS disorders疾病不在少数，可能仅次于心血管疾病和癌症，在医药市场和科研领域都是炙手可热的方向，此处的BBB就是影响化合物吸收的主要因素，约有2%的药物可以顺利的通过此屏障，进入到脑部靶点，这也是脑部疾病恢复缓慢的原因之一吧。

    

     Schematicdiagram of a cross-section of a brain capillary microvesselthat constitutes theBBB

     看着上面的结构，内皮细胞构成的毛细血管主要给脑部输送氧气和养分，细胞间的链接是更为紧密的Tight Junction，血管外紧紧的围绕着大脑细胞。脑部的血管交叉相连，有人估计脑部所有的毛细血管长度总和有400 miles，紧紧的包裹在12平方厘米的颅腔(神奇!)。若是提到脑部细胞的功能，单单涉及“记忆”的能力就足以迷倒一片科学家，许多现象无法用科学解释清楚，曾有人提到用量子生物学的方法研究大脑，就知道这片领域有多么的深奥了!可是人们还是不能放弃，因为老年人群有太多、太多的患者是中枢神经混乱，比如AD、比如Parkinson。

     谈到BBB，能通过这一关的主要是小分子的自由扩散或是凭借转运蛋白进入脑细胞的物质，代谢成分则主要通过P-gp、MRP等外排蛋白运出脑外(外排的活性比物质进入的活性要高许多)。化合物想要混入中枢，需要非常好的隐藏，具有“朋友”的特征，通过各种关卡。

    

     Rapid metabolism resulted in lowbrain exposure

     常用的一些参数可以诠释化合物渗入脑细胞的能力，如B/P (drug ratio in blood and in plasma)、LogBB (Log(B/P) )、Kp和Kp,free等表示药物在脑部的分布，Papp (BBB permeability)，PS (permeability surface area coefficient)和t1/2eq.in (the half-time to reach equilibrium between free drug in brainandplasma)表示BBB的渗透能力。

     其中好的化合物B/P>0.3(也就是有30%的化合物进入脑部)，有时也按照下面算法计算：

    

     Metabolicstability

     代谢的过程也是酶和底物反应的过程，直接影响化合物在体内的生物利用度、清除率和半衰期，主要发生在肝(也有的在小肠)，代谢稳定性可通过修饰化合物的结构来优化。记得我刚到Pharmaron的时候，我曾经的部门“PK-ADME”举办了一次活动，好像叫生物技能实验大赛，反正是学习，我啥也不懂也跟着报了名，其中一项比赛就是“Met ID”。当时一头雾水，现在看起来有些眉目了。如今Lilly也在做着微粒体代谢相关的实验，多少了解到这个过程对任何一个进入血液循环的化合物而言都是躲不开的。

     药物代谢(drug metabolism)也常被称为生物转化(Biotransformation)，分两部分：直接修饰化合物本身的Phase I 代谢，如氧化、还原、水解等，和结合极性基团的Phase II代谢，终极目的是让化合物更易溶于水再经肾脏排出体外。

     Phase I 中关键的酶是单氧酶(Monooxygenase)，主要分cytochrome P450 (CYP 450)家族和flavine monooxygenase (FMO)家族。CYPs的成员多达400余种同工酶(Isozymes)，存在于哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌等生物体内，主要依靠活性中心的亚铁血红素作为媒介传递氧气，NADPH在此过程中提供还原H。一个化合物可能被多种酶催化，这里就存在选择性的问题，多种药物同时供给时也就需要考虑DDI的事宜了(曾经看到消息称DDI也曾是药物被撤回的主要原因之一)。

     Phase II 代谢主要向化合物转移一些极性基团，如葡萄糖醛酸会添加到芳香烃或烷烃的羟基、UGTs转移羧基、硫酸根、谷胱甘肽等可以被添加到活跃的原子上。(主要几类反应附后)

    

     Mechanism of catalytic cycle forCYP450 reactions.

     (from Guengerich, F. P., &Johnson, W. W. (1997). Biochemistry 36, 14741–14750)

     化合物代谢的稳定性影响着他的pharmacokinetics (PK)特性，他与药物的清除率(Clearance, Cl, ml/min/kg)成反相关。Cl与化合物的分布体积(volume of distribution, Vd)直接影响PK中的半衰期(half-life, t1/2=0.693×Vd/Cl,min)，间接表示给药时间段与频率；Cl与化合物的吸收(Absorption)会直接影响口服生物利用度(oralbioavailability, F)，间接显示每次给药量。

     一般而言，人们希望在项目开展的早期提高化合物在体内、外的稳定性，对新和成的化合物会在体外分析可能将其代谢的酶(多数是确认那种CYP，俗称CYP phenotyping)，在项目的后期，会关注不同化合物之间的DDI。体外常用的方法就是肝微粒体实验技术，利用肝细胞的亚组份(内部含有大量的I相代谢酶)或肝细胞间接显示化合物在肝中的代谢情况，为Lead optimization提供数据，利于Chemist重新优化化合物的结构，提升化合物的代谢稳定性。

    

     Schemes for the diagnosis of in vivoPK performance using metabolicclearance

     (From van de Waterbeemd, H.,& Gifford, E. (2003). Nature ReviewsDrug Discovery 2, 192–204)

     代谢这一块涉及太多的(生物)化学，每当看到化合物结构和电子转移的图我就自动发晕，就是因为基础不牢固。不过对于肝脏代谢过程，我感觉很神奇。在人们不知道CYP的时候，这些酶就已经存在，并且辅助体内物质代谢的功能。诸如3A4、2D6、2C9、1A2等CYP是人们后来在研究药物的时候逐渐发现的，如今这些酶被单拿出来在体外分析化合物在体内可能的代谢产物、可能的清除率、可能的代谢稳定性，是不是感觉人们真的很“狡猾”？现在倒是有种感觉，体内很多“分子们”、“酶们”在协作，维持着人们保持“人”的形状，若是这里有任何一个部分发生问题，“人”将不再是“人”；若是其中的协调平衡被打破，“人”这一统一的个体将不复存在。

     话说回来，但凡是不同“个体”间的合作，总是存在漏洞或空子，而化合物就是利用这里面的空子，按照人的意识攻入体内。与其说人们的科研精神永无止境，倒不如说人们的野心不会止步。人们希望更清楚的认识自我，希望掌控自我和他人，或许这是有意识的生命体的共性。

     有时会想：科学，值得相信吗？若是你了解的科学并不完整或目前并非正确，她还值得相信吗？有可能人们之所以对相信科学，是他们实在没有办法相信其他领域。你让科学家相信God会帮助你发文章、赚职称，可能吗？

     作者信息TJ

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     作者微信公众号：The_road_of_science

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